他可说是局部解剖图宗师，不仅研究人体解剖表现杰出，而且在涉猎其他动物解剖时一样表现出色。达·芬奇不只关心身体结构，也关心生理功能，这使得他变成解剖学家和生理学家。他积极寻找外观有明显生理缺陷的人作为模特儿以便画成滑稽的画作突显生理功能的意义。值得一提的是达芬奇可以同时一手作画一手写字。
基于人体解剖研究也使得达芬奇设计出史上第一个机器人。这个被称作达·芬奇机器人(Leonardo's robot)的设计可能是在西元1495年完成但直到西元1950年代才被发现。不知这个设计是否要作成实体。
工程
由于着迷飞行现象，达·芬奇作了鸟类飞行的详细研究，同时策划了数部飞行机器，包括了直升机设计图(但因机体本身亦会旋转故无法作用)以及轻型滑翔翼。西元1496年1月3日，他曾测试了一部自制飞行机器但失败。
1502年，达·芬奇曾为伊斯坦布尔鄂图曼苏丹巴耶塞特二世的土木工程专案制作单一跨距达240米(720英尺)的桥梁草图。这个设计打算让桥梁跨越博斯普鲁斯海峡口的金角湾(Golden Horn)。但因巴耶塞特二世认为无法建设而未实作。西元2001年，奠基于达·芬奇的设计，威卜琼·山得达·芬奇专案(Vebj ørn Sand Da Vinci Project)让此桥以小桥的形式在挪威付诸实行。而在西元2006年5月17日，土耳其政府决定在实地建设达芬奇桥跨越金角湾让该桥终究成形。
1490年，达·芬奇将无段连续自动变速箱概念绘制成草图。今日，达·芬奇的变速概念以现代化形式实际使用在汽车上。此外，无段连续自动变速箱也已经在拖拉机、雪上摩托车、速克达机车等使用许多年。
由于达·芬奇曾任军事工程师，笔记中也包含了数种军事机械的设计：机关枪、人力或以马拉动的武装坦克车、子母弹、军用降落伞、含呼吸软管以猪皮制成的潜水装等等。不过，后来他却认为战争是人类最糟的活动。其他的发明包括了潜水艇、被诠译为第一个机械计算机的齿轮装置，以及被误解为发条车的第一部可程序化行动机器人。此外，达·芬奇在梵谛冈那些年里，曾计划应用太阳能而使用凹面镜来煮水。尽管达·芬奇大多数的发明在他的生平并未实现，但在IBM赞助下，实作了许多模型在昂布瓦斯的克洛斯宅达·芬奇博物馆展示。
创作
早期创作
当他在作坊学艺时 ，就表现出非凡的绘画天才。约1470年他在协助韦罗基奥绘制《基督受洗》时，虽然只画了一位跪在基督身旁的天使，但其神态、表情和柔和的色调，已明显地超过了韦罗基奥。据传，韦罗基奥为此不再作画。现存他最早的作品《受胎告知》是达·芬奇在没有老师的指导下，独立完成的一件作品。除了有一点自由构思外，这幅画的场景都是达·芬奇遵循一般的透视画法来构思的。
后来位于欧利维特峰的圣巴托罗梅欧修道院还订购了这幅作品，稍后创作的《吉内薇拉·班琪》，一反15世纪艺术追求线条分明的传统，以逆光夕照的色调渲染他所倡导的透视效果。1481年创作的《博士来拜》（又译《三王来拜》）是标志其艺术风格达到成熟期的作品。
该画虽由于他动身去米兰而没有完成，但从原稿上可看出其构图和形象塑造所显示的艺术创新，大大超越了他的老师和同辈：由圣母婴孩和三位博士所形成的三角形稳定构图，按精确的透视法画的建筑遗迹和奔腾飞跃的马群等背景，说明他已不再从叙事的角度简单地罗列有关人物，而是对传统的题材进行彻底的改造。他所采用的色调幽暗的画法，使人物形象从阴影中突出，突破了传统绘画明晰透露的特点，预示着文艺复兴的到来。
盛期创作
1482年达·芬奇来到米兰，应圣弗朗切斯教堂的邀请绘制祭坛画《岩间圣母》。这幅
画现藏于卢浮宫。《最后的晚餐》是他在这一时期的创作中最负盛名之作。这幅表现基督被捕前和门徒最后会餐诀别场面的湿壁画，绘制在米兰格雷契修道院饭厅的墙壁上。它巧妙的构图和独具匠心的布局，使画面上的厅堂与生活中的饭厅建筑结构紧密联结在一起，使观者感觉画中的情景似乎就发生在眼前。
在人物布局上，一反平列于饭桌的形式，将基督独立于画面中央，其他门徒通过各自不同的表情和手势，分别表现出惊恐、愤怒、怀疑、剖白和慌张的情绪。这种典型性格的描绘，突出了绘画的主题，它与构图的统一效果互为补充，堪称美术史上最完美的典范之作。
15世纪末期，为米兰公爵卢多维科·斯福尔扎的情妇切奇利娅·加莱拉尼创作了《抱银鼠的女子》。《抱银鼠的女子》是达·芬奇杰出的肖像画作品，体现了深厚的写实功力。这幅精美的肖像画，画面人物气质高贵沉静，女郎怀抱的白貂毛色光润，栩栩如生，充满朝气，充分体现了达·芬奇高超的绘画技巧，而形态逼真的白貂使画面生动了起来。这幅肖像画最引人注目的地方是明暗的处理，画家运用光线和阴影衬托出切奇莉亚优雅的头颅和柔美的脸庞。形神兼备，使得这幅肖像画得到世人的推崇。
1500年达·芬奇回到佛罗伦萨，随着共和国制度的恢复，文化气氛一度活跃，画坛上也先后出现了米开朗基罗、拉斐尔等杰出人物。达·芬奇开始为兰则塔大教堂的主祭坛创作《圣母子与圣安娜、圣约翰》，他向市民展出的一幅经过精心构思的《圣母子与圣安娜、圣约翰》素描草图，立即引起轰动，其构图原理和画法对艺术界有极大影响，米开朗基罗和拉斐尔等人也从中得到启发。
1503年他一面着手为市政厅绘制壁画《安吉里之战》，一面创作《蒙娜丽莎》和《圣母子与圣安娜、圣约翰》（后称为《圣母子与圣安娜》），这两幅画和《施洗者圣约翰》一起成为他极为珍爱的作品，始终带在身边，晚年移居法国也不离左右，最后遗存巴黎。1499年为躲避战乱，达·芬奇在曼图亚和威尼斯等地旅游并进行一些科学研究。
巨人长眠
达·芬奇晚年被法兰西国王弗朗索瓦一世邀入法国，弗朗索瓦一世给予了他至高的接待，将其安置于昂布瓦斯城堡中的克鲁克斯庄园，并时不时地去请教。1519年5月2日，年事已高的达·芬奇因病逝世了，据说他是在赶来的弗朗索瓦一世怀中咽下了最后一口气。他最钟爱的学生弗朗西斯科·梅尔兹（达·芬奇临终前将所有绘画作品和大量手稿都托付给了他）说：“达·芬奇的死，对每一个人都是损失，造物主无力再造出一个像他这样的天才了。”
“上天有时将美丽、优雅、才能赋予一人之身，令他之所为无不超群绝伦，显出他的天才来自上苍而非人间之力。列昂纳多正是如此。他的优雅与优美无与伦比，他的才智之高可使一切难题迎刃而解。”这是文艺复兴时期的传记作家瓦萨里对达·芬奇的赞美之词。
成就
科学
最初，人们学习科学知识也只是学习像《圣经》一样的亚里士多德理论，只相信文字记载。达·芬奇反对经院哲学家们把过去的教义和言论作为知识基础，他鼓励人们向大自然学习，到自然界中寻求知识和真理。他认为知识起源于实践，应该从实践出发，通过实践去探索科学的奥秘。
他说“理论脱离实践是最大的不幸”，“实践应以好的理论为基础”。达·芬奇提出并掌握了这种先进的科学方法，采用这种科学方法去进行科学研究，在自然科学方面作出了巨大的贡献。他提出的这一方法，后来得到了伽利略的发展，并由英国哲学家培根从理论上加以总结，成为近代自然科学最基本的研究方法。达·芬奇坚信科学，他对宗教感到厌恶，抨击天主教那些掌权的为“一个贩卖欺骗与谎言者”。他说：“真理只有一个，他不是在宗教之中，而是在科学之中。”达·芬奇的实验工作方法为后来哥白尼、伽利略、开普勒、牛顿、爱因斯坦等人的发明创造开辟了新的道路。
天文
达·芬奇对传统的“地球中心说”持否定的观点。他认为地球不是太阳系的中心，更不是宇宙的中心，而只是一颗绕太阳运转的行星，太阳本身是不运动的。达·芬奇还认为月亮自身并不发光，它只是反射太阳的光辉。他的这些观点的提出早于哥白尼的“日心说”，甚至在当时，达·芬奇就可能在幻想利用太阳能了。…
