之前，对猪等大动物在体内直接进行基因突变在技术上尚不可行。猪的基因组编辑主要依赖于受精卵注射或体细胞核移植技术来实现。但受精卵注射方式建立基因编辑动物却易产生嵌合体，需要繁殖到第二代，甚至第三代，要花2-3年的时间才能够获得有实际用途的基因编辑猪。而利用体细胞核移植技术制备基因编辑大动物模型，又因多种不可控等因素影响，体细胞克隆成功率非常低，同样耗时、耗力，且成本极高。
如今研究人员利用基因打靶技术，成功地将能够剪开基因的Cas9蛋白基因插入到猪基因组的一个特定的位点(ROSA26)，相当于在猪体内加入了一把“基因剪刀”，并且在Cas9基因附近加上了能与Cre重组酶结合的loxp位点，后者相当于一个开关，能对其剪切功能的开启加以控制。利用此工具模型，不需要依赖受精卵注射或体细胞核移植技术，研究人员就能在动物体内转入能识别特定基因的gRNA和重组酶，可直接对猪的基因组进行编辑，从而快速获得相应基因编辑猪模型。
研究人员将包装的含有Cre重组酶和靶向六种肿瘤相关基因的gRNAs慢病毒通过滴鼻方式，感染了“工具猪”的肺脏，在猪肺细胞的基因组发生癌化突变。三个月后，猪出现了典型的肺癌症状和病理变化，从而成功地建立了原发性肺肿瘤大动物模型。
这一研究成果将推动猪基因功能的研究进展，加快了在生物医药及农业领域有重要应用价值的基因修饰猪模型的建立。
“克隆犬”得来更不易
说到“克隆”这个词，很多人会想到世界上第一例运用这项技术培育出的动物——克隆羊“多莉”。它标志着生物体通过体细胞进行无性繁殖的克隆技术成为现实。随后，克隆猪、牛等纷纷问世，而克隆犬直至2005年才问世。
因为犬被科学界普遍认为是最难克隆的动物之一。
韩国是第一个成功培育出克隆犬的国家，2005年，世界首例体细胞克隆犬“史努比”在韩国诞生。直到2017年5月28日，中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学研究员带领希诺谷公司科研团队及广州生物院实验室团队，在首先获得两只基因编辑犬“苹果”和“葫芦”后，又以“苹果”体细胞作为克隆犬供体细胞，成功培育出“苹果”的克隆犬“龙龙”，这才标志着我国成为继韩国之后第二个独立掌握犬体细胞克隆技术的国家。
犬体细胞克隆困难重重
克隆犬的首要问题是如何获得足够数量成熟卵母细胞。
猪、牛、羊等动物通过体外成熟培养技术，可获得大量的成熟卵母细胞，而犬卵母细胞体外成熟培养效率极低，只能从体内获取成熟卵母细胞。体内成熟卵母细胞的获取，需要精确掌握犬发情排卵时间，一旦错过一次发情排卵时间，就需要等上半年或一年才有下一次机会。准确把握排卵时间十分困难，通过血清测定孕激素的个体间差异大，难以确立一个统一的评判标准。时间过早，卵母细胞未成熟;时间过晚，卵母细胞已老化。
其次，一只犬平均每次排卵七八枚，排出的卵子处于GV期，需要在输卵管内停留48-72h到达MⅡ期。犬卵母细胞中富含脂类物质，颜色较深，黏性很大，显微操作较困难，体细胞电融合效率不高。
最后，犬胚胎移植中，受体与供体间在生殖生理阶段上难以保持一致性。妊娠率低，再加上克隆技术本身的低效率问题，使得犬体细胞克隆更是难上加难，需要投入大量的财力、人力和物力。
“龙龙”的诞生
2013年，一种新的基因编辑技术(CRISPR/Cas9)风靡全球，它具有构建简单方便、基因打靶效率高等特点，可以让基因想要就要、想没就没，随心所欲。很快，已成功在牛、羊、猪、兔、小鼠、大鼠等动物及人类胚胎中实现了基因修饰。但它是否同样能在犬基因组中发挥作用?实验过程并非一帆风顺。
几经周折，几次更改实验方案，神奇的“基因剪刀”终于发挥了神奇的功能。2014年6月底，世界首例基因(MSTN)敲除犬“大力神”与“天狗”诞生。四个月时，“大力神”与“天狗”就表现出超强运动能力，且“天狗”还具有明显“双肌”性状(两倍肌肉)。2016年12月29日，通过犬APOE基因敲除实验，世界首例动脉粥样硬化疾病模型犬“苹果”诞生。20天后，另一只APOE基因敲除犬“葫芦”也诞生了。
“苹果”出生后，它的皮肤细胞被保存了下来。之后研发人员用“苹果”的细胞进行体细胞克隆，经过几次实验后，在2017年5月28日，中国独立培育的首只克隆犬“龙龙”才终于诞生了，它同时也是世界首例基因敲除体细胞的克隆犬。之后又有另两只同样的克隆犬诞生。(中科院广州生物医药与健康研究院博士生 王晓民)
